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本文章仅会商ALK分离探针的了局判读，EML4-ALK双色融合探针或者EML4-ALK三色探针不在本文章会商领域。

ALK分离探针设计规划：ALK基因断裂探针选取橘红色染料象征ALK基因（3’端）2p23.2区域，选取绿色染料象征ALK基因（5’端）2p23.1-p23.2区域。ALK基因断裂探针可能检测所有ALK基因沉排，预防了单独检测某一融合基因（如EML4-ALK）导致的漏诊。

可计数的组织区域应该为很好分辨的肿瘤细胞区域，如图1和图2所示，圆圈象征的区域为可计数区域，黄色箭头批示的区域为不成计数区域，由于细胞被基质环抱，只有少量的细胞分散其中。

如图3和图4所示，当组织前处置和酶消化充足时，细胞核齐全，天堑清澈，细胞之间没有沉叠，很容易分辨信号点属于哪个细胞，这样的细胞区域能够作为计数区域。

图3

图4

可计数的细胞杂交信号应该是明亮、明显和容易判读的，如图5和图6所示。拔取的细胞没有荧光布景滋扰荧光信号，如图7和图8所示。

图5 

图6

图7

图8

如图9所示，不能分辨细胞天堑，细胞成块，这样的细胞区域不能计数。如图10所示，当前处置或者酶消化不充足时，细胞之间被基质和没有消化的物质环抱，这种细胞区域也不能作为计数区域。

图9

图10

当在DAPI通路下观察细胞时，细胞核天堑不成分辨，如图11所示，细胞核观察比力难题，原因是DAPI染色不充分；当组织酶消化不充足时，细胞被基质包抄，导致细胞天堑吞吐，如图12所示，这两种情况的细胞区域都不能用来计数。

图11

图12

如图13所示，细胞核沉叠在一路，无法分辨细胞天堑，不能作为计数细胞区域。如图14所示，红绿信号均比力弱，也不能作为计数细胞区域，原因可能是细胞固定不合理。

图13

图14

当红色和绿色信号很弱或者没有信号，细胞天堑吞吐不清，细胞状态不规定和高布景，如图15和图16所示，不能作为计数细胞区域，出现这种情况的原因可能是消化过度。

图15

图16

当视野里出现明亮的荧光颗粒布景使得特异的探针信号变吞吐，如图17所示，这样的区域不能作为计数细胞区域。如图18所示，昏黄的荧光布景使得荧光信号不明显，这样的荧光布景区域也不能作为计数区域。

图17

图18

当组织出现危险或者迷失，DAPI染色弱，细胞核出现碎片状态，如图19所示；当组织细胞产生凋亡，细胞核降解，DAPI染色弱，如图20所示，这两种情况的细胞核不齐全，不能作为计数细胞。

图19

图20

当细胞之间沉叠成块，使得细胞核天堑不能分辨，如图21所示，这样的细胞不能作为计数细胞。荧光颗粒布景使得探针信号变吞吐，滋扰计数，如图22所示，这样的细胞也不能作为计数细胞。

图21

图22

当荧光信号较弱，荧光布景较高，滋扰细胞计数，如图23所示，这样的细胞不能作为计数细胞。当细胞里的荧光信号只有红色或者绿色信号时，如图24所示，这样的细胞也不能作为计数细胞。

图23

图24

典型的ALK阳性信号模式为一绿一红一融合信号模式（1G1R1F），如图25所示。当细胞的信号模式为一红一融合信号模式（1R1F）或一红两融合信号模式（1R2F）时，也记为阳性信号，如图26所示。当细胞的信号模式为两绿两红信号模式（2G2R）或两绿两红两融合信号模式（2G2R2F）时，也记为阳性信号，如图27所示。

图25

图26

图27

典型的ALK阴性信号模式为两融合信号模式（2F），如图28所示，当细胞出现2号染色体扩增，杂交信号阐发为多融合信号模式也记为阴性信号。当细胞含有一个黄色信号和红绿信号出现弥散的大局并相近，这种杂交信号记为阴性信号，如图29所示。当细胞的杂交信号阐发为一绿一融合信号模式（1G1F）或一绿两融合信号模式（1G2F）时，记为阴性信号，如图30所示。当细胞里的荧光信号只有红色或者绿色信号时，如图31所示，这样的细胞不能作为计数细胞。

图28

图29

图30

图31

总结ALK分离探针了局判读尺度如下：

计数50个肿瘤细胞，统计计数细胞中阳性和阴性细胞数量，推算Ratio值（Ratio=计数细胞中阳性细胞数量/计数细胞数×100%）

① ALK基因融合阳性

Ratio>50%时，可以为该组织为ALK基因融合阳性；

② ALK基因融合阴性

Ratio<10%时，可以为该组织为ALK基因融合阴性；

③ ALK基因融合了局不确定

Ratio在10%~50%时，需沉新选择细胞区域，再计数50个细胞，两次计数了局累加，

Ratio<15%时，可以为该组织为ALK基因融合阴性；

Ratio≥15%时，可以为该组织为ALK基因融合阳性。